ulybnidruga.ru

CRISPR, супергерой редактирования генов, стал чуточку мощнее. На прошлой неделе в Science было опубликовано три исследования, в которых ведущие лаборатории со всего мира представили новейшие дополнения к этой методике, преобразуя редактор генов в детектива вирусов или зоркого историка, который пересказывает всю историю клетки по ДНК. Как и CRISPR, эти новые технологии обзавелись забавными акронимами: CAMERA, DETECTR и SHERLOCK. Внезапный взрыв применений CRISPR четко показывает, что ученые изучили далеко не все потенциальные применения этой технологии.

Как и прежде, система активируется только в ответ на определенные сигналы ­– препараты, питательные вещества, свет или даже сигнальные молекулы клетки, вроде тех, что связаны с раком. Рекордер не только записывает присутствие сигнала; считывая долю букв ДНК, которые подверглись замене, команда также может определить его длительность и силу.

Черные ящики самолета являются ценным ресурсом для следователей, когда полет идет наперекосяк. Точно так же ученые долгое время надеялись изобрести клеточную машину времени, которая документирует события в жизни клетки – дозы радиации, всплески препаратов, приступы внутренней суматохи, которая приводит к ухудшению самочувствия клетки.

SHERLOCK, напротив, добавляется в «жертвенные» молекулы РНК, которые нарезаются в присутствии ДНК вируса или рака, чтобы вызвать положительный сигнал. Он проявляется в виде синей линии на бумажной полоске, как в тесте на беременность.

Два других исследования посвящены превращению CRISPR в чувствительный диагностический инструмент.

CAMERA обладает и другими полезными функциями. Инструмент может, например, записывать несколько сигналов одновременно. Данные также можно стереть, используя препараты, которые возвращают соотношение плазмид к исходному уровню.

SHERLOCK, основанный на системе, впервые разработанной в 2017 году, – Specific High Sensitivity Reporter unlocking – использует Cas13 в качестве режущего инструмента. У Cas13 тоже есть режим буйства, в который он погружается после уничтожения первоначальной цели.

Обратная сторона? Прожорливость Cas12 может ограничить его использование для лечения генетических заболеваний у людей. Стартап Editas уже лицензировал Cas12 для дальнейшей разработки, и новая работа ученых может помешать его амбициозным планам.

В случае с SHERLOCK Чжан и его коллеги добавили «жертвенные» молекулы РНК, которые создают сигнал после расщепления. В присутствии вирусной ДНК или РНК ­– например, Зика, Эбола или вируса лихорадки денге – Cas13 кусает вирусную мишень и жертвенную РНК, высвобождая вместе с тем положительный сигнал.

Вместе исследования подтверждают растущую исследовательскую тенденцию изучения приложений CRISPR за пределами генной терапии. По сравнению с терапией на основе CRISPR, которая требует многих лет тщательной проверки безопасности и эффективности, эти «альтернативные» способы могут спокойно войти в научный и диагностический поток гораздо быстрее.

DETECTR использует преимущество менее известного собрата Cas9 – Cas12.

Доктор Дэвид Лю из Гарвардского университета воспользовался способностью CRISPR точно нарезать ДНК и разработал «молекулярного историка» по имени CAMERA (CRISPR-mediated analogue multi-event recording apparatus).

Лу впечатлен. Новая работа, по его словам, «действительно прекрасна» и «важна». Хотя любое медицинское применение потребует долгого пути, эта система может помочь в выявлении загрязнителей окружающей среды или же отслеживать определенные молекулярные сигналы, которые преобразуют стволовые клетки в нейроны, мышцы или другие типы клеток.

«Все это демонстрирует весьма творческие способы, к которым прибегают люди, чтобы заставить работать открытия в области CRISPR и создать эти синтетические пути», говорит доктор Дейв Сэвидж, белковый инженер из Калифорнийского университета в Беркли, не принимавший участия в исследованиях.

Чтобы превратить CRISPR в настоящий мультитул, ученым пришлось исхитриться: CAMERA, клеточный рекордер, использует кольца ДНК для считывания истории клетки – например, чтобы узнать об антибиотиках или токсинах.

В отличие от клеточных рекордеров предыдущего поколения, система Лю высокочувствительна и требует лишь десятка клеток для генерации сильного сигнала. SCRIBE, похожий рекордер, разработанный доктором Тимоти Лу в MIT еще в 2014 году, требует «на порядок» больше клеток, чтобы извлечь достаточно слабый сигнал.

Он также весьма практичен для полевого использования: все реагенты находятся в бумажной полосе, которая погружается в тестовый образец. Если появляется полоска, тест положительный – никаких дорогостоящих инструментов больше не нужно.

Чтобы доказать концепцию, ученые изобрели несколько направляющих РНК, которые привязываются к разным штаммам вируса папилломы человека (ВПЧ), некоторые из которых вызывают рак шейки матки. Система DETECTR оказалась способна вычленить два особенно опасных штамма ВПЧ в бульоне из различных вирусных штаммов.

Вот как он работает. Для начала ученые изменяют направляющую CRISPR молекулу – «направляющую» РНК – в клетках бактерий, чтобы она срабатывала только после спуска курка: допустим, ввода антибиотика или другой химической атаки. После активации направляющая РНК выводит Cas9, ножницы CRISPR, в целевое местоположение. Без направляющей РНК не будет нарезки.

«Этот белок работает как надежный инструмент обнаружения ДНК из разных источников», говорит автор исследования Дженис Чен. «Мы хотим раздвинуть пределы технологии, которая имеет потенциальное применение в любой диагностической ситуации, где есть компонент ДНК, включая рак и инфекционные заболевания».

SHERLOCK 2.0, о котором было рассказано в Science на прошлой неделе, в 100 раз чувствительнее оригинала и может обнаруживать до четырех различных целей одновременно.

Наблюдая за этой любопытной активностью, ученые решили добавить молекулярные неоновые сигналы в направляющую РНК, чтобы она светилась ярким зеленым цветом после активации Cas12.

Следовательно, ученые могут с легкостью измерить соотношение двух плазмид. Используя эту систему, ученые смогли узнать, была ли клетка подвержена воздействию тетрациклина, известного антибиотика.

Как и DETECTR, это делает SHERLOCK особенно полезным во время вспышек. Технологию можно легко модифицировать для отслеживания других молекул ДНК в крови, например, которые обычно связаны с раком или стареющими клетками.

Эта первая система работала только с бактериальными клетками. Лю и его команда затем разработали вторую методику CAMERA, которая использует модифицированный Cas9. Вместо того чтобы срезать целевой ген, эти ножницы находят определенную букву ДНК и меняют ее на другую.

Что может быть лучше, чем изучить историю клетки в ДНК?

В дополнение к модифицированной системе CRISPR команда также дала клеткам два лишних кусочка ДНК, закодированных в круговой ДНК под названием плазмида. Обычно клетка экспрессирует две плазмиды с постоянной скоростью. Но как только активируется направляющая РНК, она (и Cas9) идет за одной из плазмид и съедает ее, оставляя другой нетронутым.

Тем не менее сбрасывать Cas12 со счетов пока слишком рано. В то время как человеческая ДНК разматывается в одноцепочечную ДНК (и становится мишенью Cas12), этот фермент в основном связывается с геномной ДНК. Это ограничивает его способность охотиться на потенциальные одноцепочечные жертвы, объясняет доктор Фэн Чжн из Broad Institute, который написал работу по SHERLOCK.

Хотя новые трюки CRISPR требуют испытаний, эксперты настроены оптимистично.

Как и Cas9, Cas12 следует за направляющей РНК в цель и срезает ее. Но на этом работа ножниц не останавливается. Группа под руководством Дженнифер Дудны, одного из изобретателей CRISPR в Калифорнийском университете Беркли, неожиданно обнаружила, что Cas12 остается активным после срезания цели – он мгновенно начинает охотиться за одноцепочечными молекулами ДНК, пытаясь их уничтожить.